一个广告，from bio-rad

现代生物学从分子生物学和细胞生物学开始，基本脱离了原来博物学和化学的范围而自成一体。当人们真正意识到DNA的重要性以后，分子生物学就成为了现代生物学的基础，而PCR则成为了这个基础的基础。

PCR有着所有最重要的东西相同的特点，就是它虽然时时刻刻在你身边但你从来没有意识到，比如空气。从得到一个基因到测序，从构建载体到拼接元件，从检测突变到检测含量，都离不开PCR。或者可以这样说，all starts with PCR.

PCR其实是一系列技术的综合体，包括反应体系与仪器。自从应用了耐热菌的DNA聚合酶Taq和真正完全自动化的“热循环”仪器之后，PCR就彻底摆脱了原来很可笑的人工步骤，真正走向了实用。试想，几个小时里，不停的机械的把试管在三个不同温度的水浴锅里移来移去，还要隔几个循环就加一次十分昂贵的酶，是个人都会疯掉的。

从那以后，PCR技术就没有发生过本质的改变。最多是用些高保真的酶，用些手段改善特异性，添加染料或探针做定量，或者在引物上做各种小手脚。仪器也是这样，从半导体加热元件到空气加热，添加荧光检测系统等等，现在已经发展到了做一个30个循环的反应可以在几分钟之内完成。单是准备PCR反应体系的时间就要比跑一个PCR的时间长的多了，就好比是你费了几个小时的时间去构思菜谱，购买原料，忍受烟熏火燎的制作出来的大菜，结果一口就吞下去了。

应该说PCR其他的技术层次都已经很完善了，唯一的瓶颈是DNA聚合酶的持续合成能力（processivity）。In molecular biology, processivity is a measure of the average number of nucleotides added by a DNA polymerase enzyme per association/disassociation with the template.---from wiki

所有的DNA聚合酶都没有“de novo”合成的能力，就是说，不能只提供一条单链DNA，酶就能随机结合其上而合成出互补链。必须要在这条单链上有一小段已经形成双链的DNA，酶才能结合在这段双链的一端，“补上”其余的双链。而这个酶能“补上”多长的片段，是酶的特性，所有的酶聚合能力都不会超过几个kb。这应该是进化遗留的产物，原来生物的基因组也就几个kb，这样的酶就够了，而基因组发生了几次扩增之后，并不是进化出一种全新的酶来替代，而是出现了很多辅助手段，包括用特殊的蛋白打开复杂的染色体结构，将双链解放成单链；用特异的酶合成小段的引物；用复杂的蛋白组合成DNA合成机器，使其能同时合成解开的两条单链；尤其是可以在染色体上同时打开很多起点同时复制的能力，使得基因组扩大了几百万倍的同时，DNA复制时间仅扩大了几百倍。

如果有一种“de novo”的DNA酶，我们就能在试管里（in vitro）同时扩增极大的片段，甚至整个染色体。这样的话，分子生物学上对独立基因的操作就能扩展到染色体水平，改变分子生物学研究的面貌。甚至可以尝试完全用DNA，蛋白，脂类成分“合成”一个活的细胞！

现在的DNA测序依然是原来sanger的方法，PCR然后跑胶，只不过用荧光检测代替了放射自显影，用高效色谱代替了跑胶。大片段的测序依然是个难题，这个短板就卡在了DNA酶上。所以大规模测序还是用了最笨的“鸟枪法”。虽然现在ROCHE的大规模测序技术已经可以在8小时内得到一亿个碱基的数据，但基本原理还是“鸟枪法”，只是在测序前已经把所有的小片段分离开，节省了挑克隆的时间，而且能同时检测所有小片段的序列。这是一次革命，如果全基因组测序的费用能降到个人能承受的程度，将对社会各个方面产生巨大的冲击，所以，同学们，赶紧去买roche的股票吧，那将是下一个microsoft和google。

当然，所有使用“鸟枪法”的测序手段都不可避免极大的重复工作量这个固有缺陷。在得到一定的精确度之后，如果要想再提高一个9，就要扩大几倍先前的工作，而成本和次数成正比，最终的费用将会变得不可接受。所以，真正的革命将来自于全新的方法，真正的速度与效率兼顾的方法，而不是对于现有体系的修修补补。不过那会是什么呢？

我们可以把DNA设为一根线，在一个木板上固定两根针，把线穿过这两个针眼，拉直，我们就得到了一个模型。针眼的部分应该是上文提到的解开DNA双链的蛋白聚合物，该聚合物已知是一个六聚体，中间的空恰好可以容纳单链DNA，并且以ATP为动力“拉动”DNA前进。如果我们将一个DNA酶与这两个聚合物固定为一个框架，一旦给予ATP和其他合适的条件，这个框架就会像一个老式的计算机一样按顺序“读”出DNA这条“打孔纸带”上的信息。关键问题有很多，首先这个DNA酶必须具有“super processivity”，其次，还需要找到一个合适的“read out”，得到这条新合成的链的序列信息，单条链产生的信号需要极大的放大才能被现有体系检测，如何保证信噪比与不失真？还有这套系统的组装非常麻烦，而且组装的精确度要求非常高。唉，算了，我放弃，就算做个头脑游戏好了。

跑的远了些，回到最初的PCR上来。

有一本Mullis自己写的书，名字就叫PCR，本身是一本技术资料，但是在附录里写了自己发明PCR的过程，其过程就和Kekulé发现苯环结构一样，属于出门就被馅饼砸了的那种。不过后来Mullis似乎混的并不好，PCR的专利属于他当时在的公司，后来这个公司破产了（还是因为啥被告了），PCR的专利就在几个公司间争来争去，好像现在在roche手里。

最后把PCR song的歌词贴上，娱乐娱乐。

The PCR Song

There was a time when to amplify DNA,
You had to grow tons and tons of tiny cells.

以前扩增DNA只能靠扩增细胞来获得，痛苦着呢

Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,
Said you can amplify in vitro just as well.

后来，神一般的人物出现了，在天空闪现出金字，“不要细胞也TMD能成口牙”

Just mix your template with a buffer and some primers,
Nucleotides and polymerases, too.

只要把模板，引物，dNTP，酶和buff倒进女巫的大锅搅和搅和

Denaturing, annealing, and extending.
Well it’s amazing what heating and cooling and heating will do.

口中默念“变性，退火，延伸”的六字箴言，以文武火反复煎煮

PCR, when you need to detect mutations.

PCR的大锅中浮现出变异的种子

PCR, when you need to recombine.

PCR的大锅中浮现出嫁接的苗子

PCR, when you need to find out who the daddy is.

PCR的大锅中浮现出你爸的样子

PCR, when you need to solve a crime.

PCR的大锅中浮现出罪犯的名字